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前言
HCP ELISA檢測方法必須要通過法規(guī)認(rèn)可的實驗方法(ICH或FDA指南等)進(jìn)行方法學(xué)驗證,以確保其能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。想要獲得準(zhǔn)確的HCP ELISA檢測結(jié)果,本質(zhì)上是要保證樣品中HCP的濃度高于試劑盒的定量下限(LOQ),同時HCP的檢測抗體還要處于過剩狀態(tài),滿足這兩點就必須要對檢測樣品(過程樣品和最終的藥物原液)進(jìn)行稀釋線性驗證。因此,稀釋線性(dilution linearity)是驗證HCP ELISA方法特異性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵實驗之一。在HCP檢測中,稀釋線性不佳的原因主要有兩種:一種是樣品中某些HCPs的抗體過剩條件不滿足,需要通過進(jìn)一步稀釋來達(dá)到“最小必要稀釋倍數(shù)”(MRD);另一種是產(chǎn)品蛋白本身或產(chǎn)品配方緩沖液中的某些成分對HCP的檢測產(chǎn)生干擾,可以采用指定的樣品稀釋液(見文末)或者緩沖液置換等方式處理樣品來滿足檢測需求。關(guān)于樣品稀釋液,最優(yōu)的選擇是使用和標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液。Cygnus針對每種ELISA檢測方法都提供了相應(yīng)的樣品稀釋液,以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。對于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的用戶,我們建議將可接受的稀釋線性定義為“在兩倍稀釋時,校正后的HCP濃度變化不超過±20%”。同時,還要避免檢測值靠近定量下限,即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍。接下來,本文將為您詳細(xì)解讀HCP ELISA方法學(xué)驗證中有關(guān)線性稀釋的操作方法與注意事項。
為什么要建立稀釋線性?
在測試一個新的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)ELISA方法時,建立稀釋線性是第一項基礎(chǔ)實驗,目的是確認(rèn)所選擇的HCP ELISA是否適用于您的過程樣品和藥物原液中的HCPs。當(dāng)稀釋線性確認(rèn)后,它將為進(jìn)一步的分析驗證提供所需的實驗條件信息,因此稀釋線性通常是最先進(jìn)行的驗證實驗。
具體來講,稀釋線性實驗的目的是確定ELISA方法對樣品中HCPs的反應(yīng)曲線和全定量范圍。成功驗證了稀釋線性意味著對存在于該樣品中的各種HCPs,抗體過剩條件已滿足,且樣品基質(zhì)不會影響HCP的定量,從而保證HCP ELISA檢測結(jié)果的可靠性。
如何進(jìn)行稀釋線性實驗?
在進(jìn)行ELISA分析之前,任何可能超過定量上限(ULOQ)的樣品都應(yīng)該先進(jìn)行稀釋線性實驗。其過程包括:用驗證過的樣品稀釋液對HCP待檢樣品進(jìn)行多個梯度稀釋,然后對這些稀釋樣品進(jìn)行檢測,并計算每個稀釋樣品中校正后的HCP濃度(即測得的HCP濃度×稀釋倍數(shù))。大多數(shù)情況下,在達(dá)到一定稀釋倍數(shù)后,稀釋樣品校正后的HCP濃度值會出現(xiàn)相對恒定狀態(tài),那么該稀釋倍數(shù)則被稱為“最低需求稀釋度”(MRD)。
圖1 最低需求稀釋度(MRD)
如下表案例,樣品在高濃度(未稀釋和1:2,1:4稀釋)時并未顯示出良好的稀釋線性,但隨著進(jìn)一步稀釋,我們可以確定一個MRD,即在此稀釋度實現(xiàn)了可接受的稀釋線性(見下表藍(lán)色行)。按照定義,當(dāng)校正后的HCP濃度在2倍稀釋之間的變化范圍不超過±20%時,即達(dá)到了可接受的稀釋線性,同時還要避免靠近定量下限,即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定量下限的兩倍(在這個案例中1:64稀釋樣品HCP檢測值<2倍LOQ,因此未計入統(tǒng)計)。變化百分比可以通過減去前一稀釋樣品濃度的校正值,然后將差值再除以前一個稀釋樣品濃度的校正值來計算。例如,1:2稀釋樣品相較未稀釋樣品的變化百分比為:[(233-146)/146]x100%=60%。
樣品稀釋梯度 |
HCP稀釋校正值 (ng/mL) |
與前一個稀釋樣品 的變化百分比 |
未稀釋 |
146 |
NA |
1:2 |
233 |
60% |
1:4 |
312 |
34% |
1:8 |
361 |
16% |
1:16 |
356 |
1% |
1:32 |
370 |
4% |
1:64 |
未計算 (<2倍LOQ) |
NA |
從表中數(shù)據(jù)我們可以得出結(jié)論,該樣品的MRD為1:4,那么最終計算出HCP的濃度應(yīng)在MRD以下(或等于)和LOQ以上所有校正后HCP濃度的平均值(在此例中,應(yīng)取312、361、356和370的平均值即350ng/mL)。
在實際應(yīng)用中,我們應(yīng)當(dāng)對需要檢測HCP的所有樣品類型(包括過程樣品以及最終的藥物原液)進(jìn)行稀釋線性的評估,并將每種樣品類型和基質(zhì)的MRD值以及稀釋不同樣品的具體指導(dǎo)納入到SOP文件中。
稀釋線性不佳的原因與解決方法
對于HCP ELISA檢測,可能會出現(xiàn)某些HCPs稀釋線性不佳的情況,也就是樣品中存在某些HCPs的抗體過剩條件未被滿足。例如,個別高濃度的HCP可能對該特定HCP的抗體產(chǎn)生飽和,出現(xiàn)了“鉤子效應(yīng)(high-dose hook effect)”,從而導(dǎo)致該HCP的定量不準(zhǔn)確。
圖2 鉤子效應(yīng)(high-dose hook effect)示意圖
此外,某些伴隨蛋白(hitchhiker proteins)可能會與產(chǎn)物蛋白相互作用,并在純化過程中顯著富集,從而完全干擾整個分析的線性。
圖3. 伴隨蛋白(hitchhiker proteins)與產(chǎn)物蛋白相互作用干擾分析線性
其他導(dǎo)致稀釋線性不佳的原因還有可能是產(chǎn)品配方(或過程樣品的緩沖溶液)中的某些成分干擾了檢測,對于Cygnus HCP ELISA試劑盒,已知的干擾因素包括極端pH、洗滌劑、有機溶劑、高蛋白濃度和高鹽濃度等,因此我們建議樣品的稀釋一定要使用和標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液,詳見下表。
貨號 |
品名 |
應(yīng)用 |
規(guī)格 |
I028 |
樣品稀釋液 |
適用于大部分HCP試劑盒,如CHO(F550-1),E.coli(F1020, F410)等 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
I700 |
樣品稀釋液 |
適用于HEK 293 HCP(F650S)試劑盒 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
I094 |
樣品稀釋液 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
|
I600 |
樣品稀釋液 |
適用于大部分Mix-N-Go系列Protein A檢測試劑盒(F600, F610, F740, F910, F950等)和核酸內(nèi)切酶殘留檢測試劑盒(F960) |
25 ml, 100 ml |
F031A |
樣品稀釋液 |
適用于BSA(F030)檢測試劑盒 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
I800 |
樣品稀釋液 |
適用于PROchievA? Protein A(F965)試劑盒 |
25 ml, 100 ml |
F223A |
樣品稀釋液 |
適用于NS/0 HCP(F220)試劑盒 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
F233A |
樣品稀釋液 |
適用于A549 HCP(F230)試劑盒 |
100 ml, 500 ml |
F213A |
樣品稀釋液 |
適用于山羊IgG(F210)檢測試劑盒 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
F243A |
樣品稀釋液 |
適用于山羊乳總蛋白(F230)檢測試劑盒 |
100 ml, 500 ml, 1000 ml |
Cygnus不同生物工藝雜質(zhì)檢測試劑盒對應(yīng)的樣品稀釋液一覽
最后,我們再次強調(diào),只有在抗體過剩的情況下,劑量反應(yīng)曲線才會呈正斜率,檢測結(jié)果才是準(zhǔn)確的。
如果稀釋線性不佳的因素是由HCP抗體不足或樣品基質(zhì)干擾,那么隨著樣品的稀釋倍數(shù)增加,其測得的HCP濃度會呈現(xiàn)上升趨勢,因此需要通過進(jìn)一步稀釋樣品來達(dá)到MRD。如果是其他原因,也可以通過優(yōu)化實驗步驟來提高檢測的準(zhǔn)確性。如果增加樣品的稀釋倍數(shù)仍無法解決稀釋線性不佳的問題,則有可能是純化過程存在問題。
Cygnus針對每一種檢測試劑盒均提供相應(yīng)的QS(Qualification Summary)文件,如有需求歡迎點擊這里填寫信息索取,或者聯(lián)系Cygnus中國總代理西美杰。如果您在Cygnus HCP ELISA試劑盒的使用中遇到了稀釋線性相關(guān)問題且無法通過上述方法解決的,也歡迎您隨時聯(lián)系西美杰,我們的技術(shù)支持會針對您的問題提供相應(yīng)解決方法和建議。接下來我們還會陸續(xù)分享一系列關(guān)于HCP ELISA方法學(xué)驗證的內(nèi)容,包括加標(biāo)回收以及HCP抗體適用性驗證等,敬請關(guān)注。
Cygnus Technologies專注為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法超過25年,旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒,用于檢測超過50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測的高靈敏度分析技術(shù)的專家,其產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被全球超過95%以上生物制藥公司使用,并獲得FDA、NMPA、EMA等監(jiān)管機構(gòu)的廣泛認(rèn)可。
北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國總代理,與國內(nèi)眾多知名藥企,CRO/CMO企業(yè)建立了長久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段,提高藥物質(zhì)量、純度和安全,加速優(yōu)化研發(fā)工藝,減少產(chǎn)品上市時間,降低QC成本。如您對上述產(chǎn)品感興趣,歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站m.zgcjyszx.com了解更多信息。